細(xì)胞趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學(xué)趨向性）是趨向性的一種，指細(xì)胞、細(xì)菌及其他單細(xì)胞、多細(xì)胞生物依據(jù)環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)而趨向的運(yùn)動(dòng)。趨化性對(duì)細(xì)胞的發(fā)展和其他正常功能一樣不可或缺。
在生物材料移植的時(shí)候，快速的纖維血管化是成功移植的先決條件之一。尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）和組織型纖溶酶原激活物（tPA）在纖維蛋白溶解中都發(fā)揮了重要的作用。這三種蛋白均被報(bào)道在無(wú)可溶纖維蛋白的細(xì)胞過(guò)程中有表現(xiàn)出的作用，比如細(xì)胞粘附，遷移和增殖。
德國(guó)的科研人員發(fā)現(xiàn)使用內(nèi)皮細(xì)胞做趨化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)uPA，tPA和PAI-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化遷移行為都有顯著的影響。
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：
l 倒置顯微鏡，具有4X相差物鏡和定時(shí)拍照功能（Nikon）
l 鏡載加熱孵育系統(tǒng)（37℃，5%CO2）
l 可選配置：全自動(dòng)載物臺(tái)，自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)
l 分析軟件：手動(dòng)分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊和ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
l HUVEC 細(xì)胞 （Human umbilical vein endothelial cells from Promocell）
l tPA，uPA，PAI-1 （Sino Biological）
l Matrigel （Corning）
l ECGM培養(yǎng)基 (Promocell）
l 細(xì)胞趨化載玻片（圖一） （ibidi）
圖一，ibidi 細(xì)胞趨化載玻片圖示，如圖所示，細(xì)胞種在中間通道，兩邊的儲(chǔ)液池可以放不同的刺激因子，從中間通道的觀測(cè)可以得到細(xì)胞對(duì)刺激因子的趨向性，本例是使用一邊加入uPA、tPA或PAI-1，另外一邊放入培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，兩邊都放培養(yǎng)基作為對(duì)照組。
二、細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)
1）實(shí)驗(yàn)步驟
l 將細(xì)胞與30%Matrigel的ECGM稀釋液混合，密度為3×106 cells/cm2，直接加入ibidi細(xì)胞趨化載玻片的中間通道中（圖二）
圖二，在觀測(cè)通道中加入細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液
l 將細(xì)胞趨化載玻片放入培養(yǎng)箱中30-35分鐘，等待膠凝結(jié)
l 膠凝結(jié)后后分別在兩邊儲(chǔ)液池中加入60μl的30 ng/mL的uPA、20 ng/mL的tPA或1 μg/mL的PAI-1和無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)（+/-）（圖三）
圖三：加入X-lkd IIIA4抗體（紅色）和無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍(lán)色）
l 在兩邊儲(chǔ)液池中均加入60μl的無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為空白對(duì)照（-/-）或均加入趨化因子為陽(yáng)性對(duì)照（+/+）（圖四）
圖四：加入無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍(lán)色）作為空白對(duì)照
l 按說(shuō)明，將通道加液孔塞緊后可以進(jìn)行圖像采集
l 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中，調(diào)整好采集位點(diǎn)，進(jìn)行20小時(shí)的觀測(cè)，每10分鐘采集一張圖片
三、圖像數(shù)據(jù)處理
1）手動(dòng)細(xì)胞軌跡追蹤
l 下載ImageJ，并安裝Manual Tracking模塊
l 導(dǎo)入采集的系列圖像到ImageJ中，打開(kāi)模塊“Manual Tracking”，選擇“Add track”開(kāi)始記錄細(xì)胞軌跡
l 選擇一個(gè)細(xì)胞，按照時(shí)間點(diǎn)單擊細(xì)胞，點(diǎn)擊后，會(huì)有新窗口跳出來(lái)顯示初始位置，以后每次點(diǎn)擊，都將在這個(gè)新窗口中產(chǎn)生一個(gè)該細(xì)胞隨著時(shí)間的新坐標(biāo)
l 統(tǒng)計(jì)完足夠的細(xì)胞軌跡后，保存軌跡坐標(biāo)表格
l 至少收集30個(gè)細(xì)胞的軌跡才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，避免同一細(xì)胞追蹤兩次，去除由于凋亡會(huì)而不能采集完整的軌跡的細(xì)胞
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
圖五：uPA，tPA和PAI-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化遷移行為的影響。A）為在趨化因子存在下，HUVEC細(xì)胞的趨向性運(yùn)動(dòng)軌跡。B）為統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果說(shuō)明，HUVEC細(xì)胞對(duì)uPA，tPA和PAI-1都有證趨向行為。
|
新聞資訊